Film filtranti per microscopia a fluorescenza laser

A causa della sua elevata luminosità, stabilità, lunga durata e larghezza di banda spettrale stretta, i laser stanno sostituendo gradualmente le tradizionali sorgenti luminose a banda larga nelle applicazioni di imaging a fluorescenza. Nelle applicazioni di imaging, le caratteristiche di cui sopra del laser possono migliorare la sensibilità della visualizzazione e aumentare il flusso luminoso; Il laser ha anche proprietà uniche, come angoli di emissione stretti del raggio, un'elevata coerenza temporale e spaziale e una chiara polarizzazione, che hanno ispirato molte nuove tecniche di imaging a fluorescenza. Tuttavia, quando il laser si presenta sotto forma di sorgente fluorescente, rispetto alla sorgente luminosa a banda larga, vengono introdotti nuovi requisiti e limiti per i sistemi di imaging basati su laser e i loro componenti, in particolare per le membrane di filtraggio ottico.

Filter ottico ottimizzato per la sorgente laser

Negli ultimi quattro decenni sono stati sviluppati molti laser ad alta potenza, ad alta efficienza e a basso costo. Le persone di solito classificano i laser in base al mezzo di guadagno e al metodo di eccitazione. Fino ad ora, i laser più comunemente utilizzati per l'imaging a fluorescenza sono ancora i laser a gas (come i laser a ioni di nichel e nichel) e le linee spettrali laser più comunemente utilizzate sono 488, 568 e 647 nm. Negli ultimi anni, tuttavia, i laser a stato solido stanno gradualmente sostituendo i laser a gas a causa della maggiore efficienza (minore generazione di calore e installazione di laboratorio più semplice) e dei costi più bassi. I tipi comuni di laser includono i laser a diodo semiconduttore (in particolare 405 e 635 nm), i laser a semiconduttore a pompaggio ottico (compresi i 488 nm ampiamente utilizzati) e i laser a stato solido a pompaggio a diodo a doppia frequenza (DPSS) (compresi i laser giallo 561 nm e i laser più recenti 515 nm e 594 nm).

Applicazione del filtro ottico nella microscopia a fluorescenza laser

Poiché il divisore del fascio è esposto direttamente alla luce di forte eccitazione, anche la debole fluorescenza spontanea del filtro può interferire con il segnale della luce emessa. Pertanto, dovrebbe essere utilizzato un substrato fluorescente ultra-basso come il quarzo fuso. Si noti che a causa della differenza di intensità tra la luce di eccitazione e il segnale di emissione, i requisiti per la fluorescenza del filtro di emissione non saranno così severi come per i separatori di colore. Nel microscopio, tuttavia, l'intensità del filtro di emissione è significativamente superiore a quella di un tipico filtro di microscopia a ampio angolo di fluorescenza, poiché il fascio laser nel sistema si rifletterà completamente dal vetro portatore del campione e si reindirizza lungo il percorso di emissione. Pertanto, la fluorescenza spontanea del filtro di emissione in questo sistema laser dovrebbe essere attentamente considerata rispetto alla fluorescenza spontanea in un sistema a banda larga.

In alcune applicazioni, il divisore del fascio può avere un impatto significativo sulla qualità dell'immagine, in particolare quando il divisore del colore non è piatto (curvatura). Anche se la curvatura della matrice non è influenzata dall'errore del fronte d'onda, l'errore del fronte d'onda riflettente può avere un impatto significativo sulla qualità dell'immagine. Ad esempio, quando il divisore del fascio con bassa piattazione è posizionato nel percorso di eccitazione, l'illuminazione del campione al microscopio può essere debole. Allo stesso modo, a causa delle sollecitazioni di flessione intrinseche del rivestimento duro, può causare una deviazione dell'immagine del fascio di immagine riflessa dal separatore colore. Pertanto, alcune applicazioni dovrebbero utilizzare un separatore di colore ad alto livello. Per la maggior parte dei microscopi laser, il divisore del fascio dovrebbe essere abbastanza piatto in modo che il punto focale del raggio laser irradiato non si muova in modo significativo, dove il movimento del punto focale è spesso definito dalla gamma di Rayleigh. In poche parole, il criterio di qualificazione per un raggio di imaging riflesso da un separatore colore è che la dimensione del punto di diffrazione non dovrebbe cambiare significativamente dopo la riflessione sul separatore colore.

I sistemi di imaging microscopico basati su laser sono strutturalmente complessi e costosi. Nel processo di ottenere le prestazioni più elevate da esso, il ruolo del filtro ottico è molto importante. È ancora più importante scegliere correttamente l'uso di un filtro ottico che corrisponda alle sue prestazioni. Qual è il futuro dei sistemi di imaging laser? Per osservare meglio i meccanismi di interazione tra cellule o strutture subcellulari, sono emersi molti complessi schemi di imaging. Le membrane filtranti ad alta efficienza svolgono un ruolo sempre più importante in queste applicazioni all'avanguardia.